روش انجام كومبس مستقيم

اطلاعات بیشتر در کانال تلگرامی ما (کلیک کنید)


 از این تست برای شناسایی انتی بادی های ناقص- که بر روی RBC نشسته و انها را حساس کرده است  استفاده می شود . این تست به دو روش مستقیم و غیر مستقیم انجام می شود . اساس این تست بر ایجاد شبکه بین آنتی بادی های ناقص در سطح گلبول های قرمز حساس شده (توسط AHG) برای ایجاد آگلوتیناسیون می باشد .این تست در دو مرحله کلی انجام می شود :

 


 



از کومبز مستقیم برای شناسایی آنتی بادی های ناقص متصل به RBC جنین استفاده می شود . تفاوتی که بین کومبز مستقیم و غیر مستقیم وجود دارد این است که ،  مرحله حساس شدن گلبول های قرمز در بدن جنین اتفاق می افتد . عامل اصلی حساس شدن RBC (در 75 % موارد) ناسازگاری گروه های خونی RH میباشد هر چند که گروه های خونی ABO در 25 درصد موارد هم می توانند باعث حساس شدن RBC شوند .

ناسازگاری RH


اگر خون جنینRh+   و خون مادر Rh- باشد آنتی بادی های تولید شده از کلاس Igg در بدن مادر از جفت عبور کرده و باعث حساس شدن RBC های جنین می شود .

ناسازگاری ABO


این ناسازگاری زمانی باعث حساس شدن RBC می شود که گروه خونی مادرO و گروه خونی جنین , AB باشد در این صورت انتی بادی Igg3 انتی AB موجود در سرم مادر به جنین منتقل شده و باعث حساس شدن RBC جنین میشود .

 


روش انجام تست کومبز مستقیم


خون بند ناف را گرفته و از ان سوسپانسیون 5 درصد گلبول های قرمز تهیه می کنیم . چون مرحله حساس شدن RBC در بدن جنین اتفاق افتاده است بنابراین نیازی به انکوبه کردن نیست .

0.1 میلی لیتر از سوسپانسیون 5 درصد RBC را به 0.1 میلی لیتر AHG اضافه می کنیم و برای تشکیل شبکه بین RBC ، لوله های تست را به مدت 3 تا 5 دقیقه در دمای آزمایشگاه نگه می داریم . بعد از 5 دقیقه ، لوله ها را درRpm 1000و  به مدت یک  دقیقه سانتریفیوژ می کنیم . در اخر هم لوله ها را از نظر آگلوتیناسیون با زدن ضربه ای ضعیف به لوله ، برسی می کنیم .

 برسی نتایج


اگر اگلوتیناسیون مشاهده شود ، نشان دهنده حساس بودن RBC جنین است و باید تعین تیتر شود (که در این تعین تیتر ،  AHG را رقیق می کنیم نه سرم را ) چون در زایمان دوم به بعد باعث HDN در نوزادان می شود .

از کومبز غیر مستقیم برای شناسای RBC حساس شده در محیط IN VITRO استفاده می شود . مرحله حساس شدن RBC ها در این روش توسط انکوباسیون انجام می شود . مراحل بعدی تقریبا مشابه کومبز مستقیم است . در این تست انتی بادی های ناقص ، در خون مریض (مادر) وجود دارد . این انتی بادی ها به دو علت عمده ممکن است تولید شوند :

برای بررسی وجود و یا عدم وجود این انتی بادی ، از سوسپانسیون 5 درصد RBC ، گروه خونی O+ استفاده می شود . چون آنتی بادیهای  ناقص ، شاخص های آنتی ژن RBC های گروه خونی O+ را حساس و با اضافه کردن AHG باعث ایجاد آگلوتیناسیون می شود .

علت استفاده از O+


برای اینکه ناسازگاری گروه های خونی ABO را از بین ببریم از این گروه خونی استفاده می کنیم چون اگر  گروه های خونی A,B,AB استفاد شود ، در این صورت ممکن است آنتی بادی ضدAB گروه خونی Oباعث حساس شدن سوسپانسیون شود .

و علت اینکه از RH+ استفاده می کنیم این است که می خواهیم آنتی بادی های ناقص بر روی آنتی ژن های RH+ بشیند و بتوانیم آگلوتیناسیون را مشاهده کنیم . اگر RH- باشد در روی RBC ، آنتی ژنی وجود نخواهد داشت تا RBC توسط آنتی بادی حساس شود .

 


روش انجام تست کومبز غیر مستقیم


0.1 میلیمتر از سرم بیمار را با 0.1 میلیمتر از سوسپانسیون 5 درصد مخلوط می کنیم و سپس لوله آزمایش را به مدت 30 تا 40 دقیقه در انکوباتور37 درجه قرار می دهیم در این مرحله RBC در صورت وجود انتی بادی ناقص در سرم ، حساس خواهند شد . بعد از این مدت ، لوله آزمایش را به مدت یک دقیقه در دور 1000 سانتریفیوژ می کنیم . و سه بار توسط سرم فیزیولوژی شستشو می دهیم تا آنتی بادی های غیر اختصاصی حذف شوند و فقط آنتی  بادی های اختصاصی که به شاخص های انتی ژنی RBCچسبیده اند ، باقی بمانند . بعداز این مراحل یک قطره AHG به لوله اضافه می کنیم و بعد از 3 تا 5 دقیقه لوله را به مدت یک دقیقه در دور 1000 سانتریفیوژ می کنیم و در آخر هم با زدن ضربه ای ضعیف اگلوتیناسیون را برسی می کینم.

 


برسی نتایج


اگر اگلوتیناسیون مشاهده شود تست کومبز غیر مستقیم بیمار را مثبت گزارش می کنیم .

چند نکته :


 در اخر هم روش تهیه سوسپانسیون پنج درصد را توضیح می دهیم هر چند که این روش برای همه آزمایشگاهی ها چیز بسیار پیش پا افتاده است اما برای برخی دانشجویان تازه کار دغدعه ای بس بزرگ است !!

2 قطره خون داخل لوله آزمايش مي ريزيم. 3 میلی لیتر  سرم فیزيولوژي به لوله اضافه مي كنيم و در سانتريفيوژ در دور 3000 به مدت 5 دقيقه قرار مي دهيم سپس مايع رويي را خالي كرده و اين كار را تا 3 بار تكرار مي كنيم.

 موفق باشین


نسخه جدید تست کومبس به روز رسانی شد (تاریخ 5 شهریور 95)- کلیک کنید

اطلاعات بیشتر در کانال تلگرامی ما (کلیک کنید)


کومبس مستقیم: این کومبس برای بررسی RBC های حساس شده در داخل بدن مورد استفاده قرار می گیرد اگر به خاطر عوامل اتوایمیون یا عوامل ایمیون آنتی بادی برعلیه آنتی ژنهای غشاء RBC وجود داشته باشد در داخل بدن اتصال آنتی بادی با آنتی ژن مورد نظر اتفاق می افتد اگر آنتی بادی، IgG باشد با کومبس مستقیم قابل تشخیص است ولی اگر آنتی بادی IgM باشد به طور غیر مستقیم اجزاء کمپلمان را فعال کرده و اجزاء اولیه مثل C3b، C4b وC3d در غشاء RBC باقی می ماند با استفاده از آنتی هیومن ضد اجزا کمپلمان می توان این نوع ناسازگاری را هم مشخص کرد.

موارد استفاده از کومبس مستقیم:


1.ناسازگاری خون بین مادر و جنین: کومبس مستقیم در این مواقع بر روی RBC های جنین یا نوزاد انجام میشود.

2.بیماریهای اتوایمیون (هم نوع گرم هم نوع سرد): در نوع گرم IgG وجود دارد در نوع سرد IgM و اجزا کمپلمان.

3.در برخی بیماریها که تولید اتوآنتی بادی شایع است برای مثال CLL (لوسمی لنفوسیتیک مزمن)

4.آنمی همولیتیک وابسته به دارو: دارو به چندین طریق باعث ایجاد آنمی همولیتیک می شود نتیجه ی آن اتصال IgG یا اجزا کمپلمان به غشاء RBC است.

5.آنمی همولیتیک بعد از انتقال خون که با اتصال آنتی بادی یا اجزا کمپلمان به غشا RBC همراه است.

کومبس غیر مستقیم: این نوع کومبس برای بررسی RBC های حساس شده با IgG، اجزا کمپلمان در محیط آزمایشگاه به کار می رود و حتماً باید سرم بیمار با  RBC های غنی از انواع آنتی ژن (O pooled) در محیط آزمایشگاه مخلوط شود اتصال آنتی بادی در کومبس غیر مستقیم در محیط آزمایشگاه صورت می گیرد ولی کومبس مستقیم در محیط داخل بدن صورت می گیرد.

موارد استفاده از کومبس غیر مستقیم:


1.آنمی همولیتیک نوزادان با استفاده از سرم مادر


2.آنمی های همولیتیک اتوایمیون: در اغلب آنمی های همولیتیک اتوایمیون همزمان با آنتی بادی های غشاء RBC آنتی بادی در سرم نیز وجود دارد به همین خاطر می توان از کومبس غیر مستقیم استفاده کرد.

3.برای تشخیص برخی آنتی بادی های مشکوک و تعیین هویت آنها در سرم افراد برای مثال برای تشخیص Anti D، Anti C و Anti K و…

4.گروه بندی سایر گروههای خونی: Du، Kell، Duffy و … قدرت آگلوتیناسیون آنتی بادی های ضد این گروههای خونی بسیار ضعیف است به همین خاطر با آگلوتیناسیون مستقیم قابل تشخیص نیستند با استفاده از کومبس غیر مستقیم می توان گروه بندی را انجام داد.

5.آزمون سازگاری یا آزمون کراس مچ


انواع آنتی هیومن استفاده شده در آزمون کومبس: آنتی هیومن یا تک اختصاصی mono specific یا چند اختصاصی poly specific است. آنتی هیومن تک اختصاصی فقط بر علیه FC، IgG یا بر علیه اجزا کمپلمان است در برخی مواقع به خاطر تشخیص IgG یا اجزا کمپلمان از این آنتی هیومن استفاده می کنند برای مثال در Du از آنتی هیومن بر علیه Fc، IgG استفاده می شود آنتی هیومن چند اختصاصی مخلوطی از آنتی هیومن ضد IgG و اجزا کمپلمان است یعنی هر دو خاصیت را با هم دارد آنتی هیومن همچنین ممکن است مونوکلونال یا پلی کلونال باشد اغلب قدرت آگلوتیناسیون پلی کلونال ببشتر از مونوکلونال است.

منظور از شستشوی RBC ها چیست؟ شستشوی RBC ها یعنی خارج کردن پلاسما، WBC، پلاکت و باقی ماندن RBC های خالص می باشد هر چه قدر تعداد شستشو بیشتر باشد RBC های خالص تهیه خواهد شد به همین خاطر بهتر است 3 الی 5 بار ادامه پیدا کند شستشو همان  تهیه رقت است که در مرحله ی سوم شستشو رقت های بسیار، بسیار کمی از پلاسما و WBC باقی می ماند.آنتی هیومن گلوبین دارای تیتر بسیار پایین است به همین خاطر به راحتی خنثی می شود یک قطره از رقت های بسیار کم سرم می تواند یک ویال کامل از آنتی هیومن را خنثی کند به همین خاطر باید در موقع اضافه کردن آنتی هیومن نوک قطره چکان با جدار لوله ، با میز و دست تماس حاصل نکند چون احتمال خنثی شدن وجود دارد برای کنترل آنتی هیومن از سلولهای حساس (check cell) استفاده می کنند.

طرز تهیه RBC های حساس: بر روی RBC های O مثبت رقت بسیار کمی از Anti D را اضافه کرده (  ،  و  ) چون در این رقت قدرت آگلوتیناسیون وجود ندارد فقط Anti D به غشاء RBC متصل می شود بعد از شستشوی این RBC ها سلول حساس تهیه می شود باید توجه داشت که Anti D استفاده شده از نوع IgG باشد.

طرز استفاده از سلول حساس: در مرحله آخر کومبس اگر آگلوتیناسیون مشاهده نشود یک قطره سلول حساس به محیط اضافه می شود بعد از سانتریفوژ حتماً باید آگلوتیناسیون مشاهده شود چون هم آنتی هیومن و هم RBC های حساس با IgG اگر در این مرحله آگلوتیناسیون مشاهده نشد دلیل بر خنثی شدن آنتی هیومن است.

منابع خطا در آزمون های کومبس:


1.مراحل شستشو باید کامل باشد در غیر این صورت باقی ماند سرم در محیط منجر به خنثی شدن آنتی هیومن و درنتیجه باعث ایجاد منفی کاذب می شود.

2.انجام کومبس بر روی خون لخته به خاطر وجود کلسیم در محیط و فعال شدن کمپلمان ممکن است ایجاد مثبت کاذب کند.

3.اگر نمونه ی خون برای آزمون کومبس از ست تزریقی سرم قندی تهیه شود احتمال مثبت کاذب وجود دارد علت آن کاهش قدرت یونی محیط در حضور قند می باشد که در نتیجه آن کمپلمان جذب غشاء RBC می شود و ایجاد مثبت کاذب می نماید.

4.آلودگی خون با عوامل عفونی مثل باکتریها باعث ظاهر شدن برخی از آنتی ژنهای T می شود که در نتیجه ی آن آگلوتیناسیون خود به خودی وایجاد مثبت کاذب اتفاق می افتد.

5.آلودگی خون بند ناف به ژله ی وارتون در کومبس مستقیم باعث ایجاد مثبت کاذب می شود.

6.در آزمون کومبس استفاده از سرم به جای پلاسما ارجح تر است چون برای بررسی برخی از آنتی بادی ها مثل آنتی بادی های ضد Kidd فعالیت کمپلمان ضروری است این عمل در حضور عوامل ضد انعقادی به خاطر خارج شدن کلیسم از محیط صورت نمی گیرد.

7.نگهداری سرم فیزیولوژی در ظروف شیشه ای احتمال مثبت کاذب دارد چون ذرات سیلیس باعث جذب غیر اختصاصی اجزا کمپلمان و آگلوتیناسیون غیر اختصاصی می شود.

8.خرابی آنتی هیومن باعث منفی کاذب می شود.


9.بالا بودن دور و زمان سانتریفوژ درحین قرائت آگلوتیناسیون باعث مثبت کاذب و پایین بودن آن باعث منفی کاذب می شود.

10. RBC های حساس زیر آستانه تشخیص: اگر آنتی بادی یا اجزا کمپلمان در غشاء RBC کمتر از 500 عدد باشد آنتی هیومن گلوبولین قادر به تشخیص آنها نیست که اصطلاحاً به آن آزمون کومبس زیر آستانه تشخیص گفته می شود برای تشخیص این نوع RBC ها از تست های زیر استفاده می کنند:

1.آزمون مصرف آنتی هیومن گلوبولین نشان دار.


2.استفاده از پروتئین A استافیلوکوک نشان دار.


بعد ازاتصال آنتی هیومن گلوبولین نشان دار و پروتئین A استاف به Fc ،IgG ، rbc ها را شستشو داده و سپس مقدار رادیواکتیوی محیط را اندازه می گیرند (با استفاده از گاماکانتر) اگر گاما وجود داشته باشد دلیل بر مصرف یا اتصال آنتی هیومن به پروتئین A است که نشان دهنده ی مثبت بودن کومبس است.

  RSS 



%PDF-1.4 % 1 0 obj /Author (admin) /Creator (pdfFactory Pro www.pdffactory.com) /Producer (pdfFactory Pro 4.81 (Windows XP Professional x86)) /CreationDate (D:20150610110055+04’30’) >> endobj 5 0 obj >stream HWɎ7W(v/}Ҁ/s3lAO


نام کاربری


رمز ورود


مرا بخاطر داشته باش




 معمولاً آزمایشCBC  شامل اجزای زیر است: …


 …


آب خالص و کنترل کیفی آن کیفیت نا مرغوب آب اثر نا مطلوبی بر نتایج آزمایش ها دارد…

New Page 3


تست کومبس غیر مستقیم: (In Direct Coombs) در این آزمایش آنتی کرهای ناقص( از نوع IgG )موجود در سرم بیمار مورد بررسی قرار می گیرد. موارد استفاده از این آزمایش عبارت است از: 1.Antibody Screening Test 2.تشخیص نوع یا ماهیت آنتی بادی ( Panel Test ) 3.Cross Match 4.آزمایش DU 5.تیتراسیون آنتی D در زنان باردار روش آزمایش 1.سه قطره از سرم بیمار را در یک لوله بریزید و یک قطره از سوسپانسیون 3تا5 درصد از گروه خونی O را به آن افزوده و به خوبی مخلوط کنید. 2.لوله مذکور رایک ساعت در بن ماری 37 درجه سانتیگراد قرار دهید. 3.پس از طی این زمان آن را سه بار با سرم فیزیولوژی شستشو دهید. 4.یک قطره آنتی هیومن به لوله اضافه نموده ،30ثانیه در دور 3400دور در دقیقه سانتریفوژ نمایید. 5.لوله رابه آرامی تکان داده و از نظر آگلوتیناسیون بررسی نمایید ،واکنشهای منفی را توسط میکروسکوپ کنترل کنید. نکته 1 استفاده از کنترلهای مثبت ومنفی به همراه نمونه مورد نظر جهت تایید نتیجه ضروری است. نکته 2 جهت جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب ،سوسپانسیون گلبولی O را از نظر کومبس مستقیم کنترل نمایید و فقط در صورت منفی بودن ازآن جهت انجام تست کومبس غیر مستقیم استفاده کنید.  

نام (اجباری)


آدرس پست الکترونیکی (اجباری است اما نمایش داده نمی‌شود)

آدرس سایت



مرا برای دیدگاه‌های بعدی به یاد بسپار


تصویر امنیتی جدید


مشاور و مجری الزامات آزمایشگاه مرجع سلامت

طراحی سایت


9

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *